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原代细胞培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此,较为严格地说是指成功传代之前的培养,此时的细胞保持原有细胞的基本性质,如果是正常细胞,仍然保留二倍体数。
但实际上,通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。
原代细胞培养技术方法都有哪几种?
1、选用生长情况好,数量较多的原代细胞,冻存前一天换液一次。
2、贴壁细胞需用0.25%胰酶常规消化将细胞消化下来,将细胞悬液收集至离心管中。
3、1000rpm离心5分钟,弃上清液。
4、沉淀加含DMSO的培养液,计数,调整至(1-10)×106/ml。
5、将悬液分至冻存管中,每管1ml。
6、密封冻存管,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。
7、用记号笔标明细胞种类,冻存日期。
8、按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟〕→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(—80℃过夜)→液氮。
1、取出细胞,迅速放入37℃温水中快速解冻。
2、吸出细胞悬液,并加10倍以上培养液。
3、1000r/分钟离心5分钟,去除上清。
4、用培养液适当稀释后接种培养瓶,放入37℃ CO2培养箱静置培养。
镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液,继续培养。
一.台盼蓝染色
1、制备单个细胞悬液,并作适当稀释(106细胞/ml)。
2、染色:取9滴细胞悬液移入小试管中,加一滴0.4%台盼蓝溶液,混匀。
3、计数:在3分钟内,用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。
4、镜下观察,死细胞被染成蓝色,而活细胞拒染。
5、按公式计算细胞活力。
二.伊红Y染色
1、制备1×106-5×106细胞/ml的细胞悬液。
2、取0.1ml细胞悬液加0.1ml伊红Y染液混合。
3、用计数板镜下计数活、死细胞数。
4、镜下观察,着红色的为死细胞。按公式计算细胞活力。
三.苯胺黑染色实验
1、制备1×106-5×106细胞/ml的细胞悬液。
2、将1份1%苯胺黑溶液与含血清生理盐水作1:9混合稀释,使其成0.1%苯胺黑染液。
3、取0.1ml细胞悬液加0.1ml苯胺黑染液混合。室温放置10分钟。
4、用计数板镜下计数 ,黑色细胞为死细胞,按公式计算活细胞率。
1、准备计数板:用酒精清洁计数板及专用盖玻片,然后轻轻拭干。
2、制备细胞悬液:用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞,制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104/ml,若细胞数很少,应将悬液离心(1000rpm,2分钟),重悬浮于少量培养液中。
3、加样:用习惯轻吹打细胞悬液,取少许细胞悬液,在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。
4、计数:计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10000。
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