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布鲁氏菌的实验室检测方法

日期:2017-03-03 人气:4651

荧光偏振方法(Fluorescence polarisation assay, FPA)是以荧光素标记物作为示踪剂来检测抗原/抗体相互作用的一种简便技术,该方法属于同源性分析,分析物不需进行分离,因而该法简便快捷。FPA 诊断布鲁氏菌的特异性和敏感性几乎和竞争 ELISA (Competitive enzyme-linked immunosorbent assay,C-ELISA)相同,一次检测仅需15 min,即可完成上百份样品的检测,可应用于动物群体布鲁氏菌病的检疫、筛查和净化。FPA 检测方法在某些发达国家已经得到了大量应用,并经研制开发了商品化 FPA 检测试剂盒。


而我国对 FPA 检测方法的研究起步较晚,目前尚无商品化 FPA 检测试剂盒,进出口贸易中牛、羊布鲁氏菌病 FPA 检测方法均依赖于使用进口试剂盒,因此开发布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法有其现实意义。本研究使用异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的布鲁氏菌光滑型 LPS 的小分子片段脂多糖-O-链(O-polysaccharide,OPS) 作为抗原,通过对标记抗原、反应条件、结果判断标准等多方面条件的优化,建立敏感性和特异性良好的布鲁氏菌荧光偏振方法,为多种动物布病检测提供快速高通量的新技术手段。


材料与方法


1 材料


1.1 菌种:猪布鲁氏菌 S2 菌株(CVCC 70502)由本实验室保存。


1.2 实验用血清:布鲁氏菌病阳性血清国家标准品由本实验保存,布鲁氏菌病阴、阳性血清样本由本实验采集并保存。


1.3 主要试剂和仪器:布鲁氏菌荧光偏振试剂盒购自 Diachemix 公司;胰大豆肉汤(TSB)和胰大豆琼脂(TSA)购自美国BD公司;异硫氰酸荧光素(FITC)、表面活性剂脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)、三乙胺购自 Sigma 公司;SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购自康为世纪公司。低温离心机购自 Sigma 公司;超声破碎仪购自新芝生物科技有限公司;Powerpac Universal 通用型电源购自美国 Bio-Rad 公司。


目前,国内主要采取的布鲁氏菌病血清学检测方法有虎红平板凝集试验、试管凝集试验及酶联免疫吸附试验,以及全血培养等方法。虎红平板凝集试验初筛,试管凝集试验定性的检测方法。当人感染布鲁氏菌后产生最多且持续时间最长的抗体是 IgG,其次就是 IgM 抗体,虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测的主要是 IgM 抗体,较容易受到体内其它IgM 抗体的干扰。虎红平板凝集试验特异性不高,受试验温度、凝集时间相对较短和人为主观因素的影响,不易准确判定结果,只能作为初筛,难免会有假阴性结果出现;而试管凝集试验是我国布鲁氏菌病的法定检测判定方法,但是该方法操作繁琐、费时,不适于大批量标本的检测,也受人为主观因素的影响。而采用 ELISA 法也是很好的方法,检出率高,但不容易判断患者的疾病发展阶段,即便患者康复后IgG 抗体也要在体内持续一段时间,因体内首先产生的 IgM抗体,感染初期容易漏检,但此种方法检测的敏感性和特异性好,反应时间短,避免了人为因素的干扰,易标准化和质量控制,但也只能用于初筛;血培养方法,一般作为诊断方法,直接进行病原学诊断,检查阳性,可直接判定布鲁氏菌感染,此种方法与采血时机、采血部位、采血量以及患者菌血浓度的影响,容易造成假阴性结果。


  通过以上对实验数据的分析,对布鲁氏菌病实验室检测的四种方法各有优缺点,只有掌握其试验方法学知识,对不同方法实验室检测结果,结合临床做出正确诊断与鉴别诊断,不能被试验方法学的局限性所蒙蔽,合理判断疾病的发展阶段,给予合理解释,对布鲁氏菌病给予合理治疗和用药,达到预期效果。


布鲁氏菌(Brucella)是一种胞内寄生革兰氏阴性菌,能引起人和多种动物的急性和慢性感染,布鲁氏菌病(简称“布病”)以流产和发热为特征,能够导致母畜流产、早产、不孕不育和产奶量下降,以及公畜睾丸炎和个体瘦弱等临床症状。


更严重的是,人感染布鲁氏菌后往往难以治愈,从而造成严重的公共卫生问题。近年来,布病感染病例呈回升态势,早期快速检测是治疗和预防布病的关键环节。布病检测的常规方法包括细菌学和血清学方法。


细菌学方法是布病流行、疫情判定及临床诊断中最直接的证据,但存在安全隐患且耗时长,在人群之间病例的检查及暴发调查等紧急情况下并不适用。自Weight在1897年建立了试管凝集反应后,血清学检测技术得到快速的发展和改进,包括各种凝集反应、沉淀反应、补体结合反应、试纸试验、标记抗体技术以及20 世纪70年代发展起来的高灵敏度酶联免疫吸附试验。其中补体结合试验(Complement fixation test,CFT)是公认的确诊方法,但其实验条件复杂苛刻,结果判断也具有一定主观性,目前在国内很少被采用。


试管凝集反应 (Serum agglutination test,SAT)敏感性较高,但单独使用时特异性较差,而且部分感染动物的抗体滴度达不到诊断水平,因而也易造成误诊和漏诊。高灵敏度、简便、快速的检测技术正在取代现有的常规测试。

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