微生物菌种保存和使用

菌种保存对于临床微生物有这十分重要的意义。细菌实验室除了长期留存日常监测用的标准菌株外，通常也会保存一些有意义的菌种，对于保存和使用生物学性状的稳定性不发生改变的菌种，质量是关键。那么，菌种应如何保存和使用，本人将工作中的一些经验和体会总结如下： 

一、实验室应建立完善的菌种保管和使用制度

1、菌种的管理应由专人负责，并且最好有两人共同进行保管，同时，科室负责人应经常进行监督检查。

2、菌种应保存在安全的地方，所用冰箱或储物柜应加锁，并设双人双锁。

3、菌种的保存、使用、传代、转移、销毁等处理都应严格按照有关规定进行操作，并有完整的记录。

4、菌种应定期进行转种传代，并且转种数代后应作一次生化、血清学鉴定。

二、一般的细菌实验室保存菌种有5大类

1、致病性球菌，如金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等；

2、肠杆菌科的细菌，如病源性大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌等；

3、弧菌科的细菌，如副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌等；

4、革兰阳性杆菌，如蜡样芽胞杆菌等；

5、非发酵菌，如铜绿假单胞菌等。

三、菌种保存的方法

菌种保存的方法包括培养基保存法、干燥保存法和冷冻干燥保存法。以上所介绍的5类菌种，一般都可以用半固体穿刺法保存，即把要保存的细菌穿刺接种于琼脂半固体内，经36℃培养18～24h后，再以无菌手续加入灭菌的液体石蜡油或肉汤，液体高度约为1cm，置4℃保存。实验证明，病源性大肠埃希菌、沙门菌、蜡样芽胞杆菌、枯草杆菌等用此方法保存3年仍可存活，其它菌种也可保存数月至半年。另外，以上各菌种也可用琼脂固体斜面保存，但该法保存时间较短，一般只有一月至数月。另外也可用商品化菌种保存以及细菌鉴定卡菌种保存，这两种方法操作简单易保存，但价格偏高。

四、菌种的使用

1、如果是半固体加肉汤保存的菌种，可以直接取肉汤划线分离接种在选择性平板上，36℃培养18～24h后挑取典型菌落作纯培养以供使用。

2、如果是半固体加液体石蜡油保存的菌种，则需要将液体石蜡油倾去，加入肉汤进行复苏，36℃培养18～24h后，再取肉汤划线分离接种在选择性平板上，36℃培养18～24h后挑取典型菌落作纯培养以供使用。

五、菌种保存和使用中应注意的几个问题

1、要保存的菌种最好制备2至3套，2套用琼脂半固体保存，一般情况下不使用，只是转种时才取出来；另一套用琼脂固体斜面保存，因其使用方便，专供日常工作使用。

2、副溶血性弧菌、非O1/O139霍乱弧菌及铜绿假单胞菌等菌种最好在常温下保存，而其它菌种则需置4℃保存。

3、一些营养要求较高的细菌，如乙型溶血性链球菌，则不能用琼脂半固体保存的方法保存，而要用血琼脂平板（有备件的实验室可用血琼脂斜面）保存，而且需要每个月转种1次。也可使用商品化菌种保存法。

4、对于带有Vi抗原的菌种，如伤寒沙门菌、丙型副伤寒沙门菌则要特别注意。因为Vi抗原在普通营养琼脂经转种数代后，比较容易丢失。因而，保存该类菌种时，最好用琼脂半固体保存的同时，再接种一支鸡蛋斜面。

5、细菌经较长时间的保存后，其形态和生化特性会发生改变，因此，我们在转种时，应在选择性平板上挑取较为典型的菌落，并且要适时进行鉴定，以保持菌种原有的生物学特性。