重组质粒在真核细胞中的瞬时表达

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞及质粒：大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)、牛乳源 SA 分离株 GY278、GY309 及 293T 细胞由新疆农业大学动物医学学院微生物与免疫实验室保存。重组质粒 pVAX1-FnBPA-A、 pVAX1-FnBPA-D、pVAX1-ClfA、pVAX1-EfB、 pVAX1-GFP，重组蛋白 EfB、FnBPA-A、FnBPA-D 及 ClfA，由新疆农业大学动物医学学院微生物实验室构建并保存。

1.1.2 实验动物：2.0–2.5 kg 雌性新西兰大白兔，购于新疆医科大学实验动物中心。

1.1.3 主要试剂：质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，真核转染试剂购于北京威格拉斯生物技术有限公司，HRP 标记山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。DiI、 CFSE 均购自 Thermo Fisher 公司。

1.2 重组质粒在真核细胞中的瞬时表达

将纯化后的重组质粒 pVAX1-ClfA 、 pVAX1-FnBPA-A、pVAX1-FnBPA-D、pVAX1-EfB、 pVAX-1 和 pVAX1-GFP 按转染说明书转染 293T 单层细胞，以 pVAX-1、pVAX1-GFP 作对照。转染后 48 h 细胞固定 30 min，洗涤 3 次；0.2% Triton X-100 处理细胞 5 min，封闭 30 min，洗涤 3 次；分别加入 ClfA、FnBPA-A、FnBPA-D、EfB 多克隆抗体及阴性抗体作用 1 h，PBS 洗涤 3 次；加入 1∶500 稀释的 FITC 标记羊抗兔二抗，37 °C 作用 45 min，PBS 洗涤 3 次，封片，荧光显微镜观察结果。

1.3 重组质粒免疫实验兔

将 24 只雌性新西兰大白兔随机分为 8 组，每组 3 只。分别为 FnBPA-A 组、ClfA 组、FnBPA-D 组、EfB 组、ClfA+FnBPA-A 组、ClfA+FnBPA-D 组、ClfA+EfB 组、PBS 对照组。将纯化的重组质粒与壳聚糖等体积混匀，700 μg/只腿部肌肉注射；3 周后进行第二次免疫，免疫方法同上。首次免疫后 0、15、32、37、42 d 采血，分离血清备用。

1.4 酶联免疫吸附(ELISA)检测抗体

用间接 ELISA 方法检测多克隆抗体效价。用 ClfA、EfB、FnBPA-A、FnBPA-D 重组蛋白包被 ELISA 板，100 ng/孔，4 °C 过夜，封闭 1 h，1∶300 稀释的各组免疫兔血清为一抗，1∶4000 稀释 HRP 标记的羊抗兔 IgG 作二抗，37 °C 作用 45 min，洗涤 5 次，TMB 显色，1 mol/L 硫酸终止反应，测定 OD450 值。

1.5 牛乳腺上皮细胞的分离纯化培养及鉴定

剪取新鲜的牛乳腺组织切除脂肪及结缔组织并用灭菌 PBS 洗涤，剪切并吹打分散培养，胰酶消化除去成纤维细胞，继续培养。用免疫荧光染色法鉴定纯化后的乳腺细胞中角蛋白 18 的表达。将纯化的乳腺上皮细胞加入有盖玻片的培养板中培养，以 4%多聚甲醛固定 10 min，洗涤 3 次。封闭 30 min，PBS 洗涤 3 次。加入 1﹕100 兔抗角蛋白 18 抗体，37 °C 孵育 1 h，洗涤 3 次。1∶100 FITC-山羊抗兔 IgG 抗体，37 °C 作用 1 h，洗涤 3 次，荧光显微镜观察。

1.6 细菌的培养

将 SA 菌株 GY278、GY309 接种于鲜血培养基 37 °C 过夜培养。挑取单菌落接种于液体培养基中培养 5 h，收集菌体用 DMEM 重悬并调节菌体浓度为 1×108 CFU/mL。

1.7 抗体对黏附的抑制

待乳腺上皮细胞生长汇集达到 80%时，PBS 洗涤 3 次，0.2% Triton X-100 作用 5 min。以 MOI=100∶1 比例用 SA 与细胞作用 2 h，对照组用 DMEM 培养液处理。PBS 洗涤 3 次，胰蛋白酶消化，终止消化后 1∶10000 稀释，取 100 μL 细胞液涂板(3 个重复)，37 °C 培养进行菌落计数。将 50 μL ClfA、FnBPA 及 EfB 特异血清(1∶5 稀释)与 SA (5×108 CFU/mL) 37 °C 作用 1 h。将与抗体作用后的细菌按 MOI=100∶1 加到乳腺上皮细胞中，37 °C 作用 1 h。PBS 洗涤 5 次。胰酶消化使细胞分散。将细胞进行 1∶10000 稀释，取 100 μL 细胞液涂板(3 个重复)，37 °C 培养进行菌落计数。

1.8 荧光染色法观察黏附及黏附抑制

将培养的 SA 用 PBS 洗涤 3 次；用含 1∶1000 CFSE 染料染色 10 min。细胞生长汇集达 80%，PBS 洗涤 2 次；用 DiI 染色 10 min；PBS 洗涤 3 次。将染色后的 SA 与乳腺上皮细胞 37 °C、5% CO2 条件下作用 2 h，洗涤 5 次，封片后用荧光显微镜观察黏附。将染色后的 SA 与等体积的含黏附素分子免疫血清(1∶5 稀释) 37 °C 作用 30 min (3 个重复)，将与抗体作用后的细菌按 MOI=100∶1 加到染色后的乳腺上皮细胞中作用 2 h，PBS 洗涤 3 次，封片后荧光显微镜观察。