金黄色葡萄球菌抑制上皮细胞效果的比较

摘要：【目的】为从免疫的角度比较和分析黏附素分子细胞外纤维蛋白原结合蛋白(Extracellular fibrinogen-binding protein，EfB)和纤维连接蛋白结合蛋 A (Fibronection binding protein，FnBP)对聚集因子 A (Clumping factor A，ClfA)抑制牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)黏附牛乳腺原代上皮细胞作用的增强效果。

【方法】本试验分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定；将真核重组质粒 EfB 和 FnBPA 分别与 ClfA 组合免疫新西兰大白兔，并利用免疫后抗体体外抑制 2 株 SA 分离株侵染牛乳腺上皮细胞，采用平板计数法定量检测与比较不同免疫组合诱导抗体对黏附的抑制作用；对 SA 和乳腺上皮细胞分别进行荧光染色，观察不同免疫组合诱导的抗体对黏附抑制效果的差异。

【结果】成功分离培养了牛乳腺原代上皮细胞；证明了构建的 ClfA、FnBPA 和 EfB 真核重组表达质粒均可在细胞中表达，且在免疫实验兔后可诱导特异性抗体的产生；细菌平板计数和荧光染色观察的结果表明，黏附素分子单独和组合免疫的抗体对该菌不同菌株(GY278 和 GY309)的黏附抑制能力不同，ClfA 抗体的黏附抑制能力最强，FnBPA 分子 A 区的黏附抑制能力优于 D 区。FnBPA、EfB 分别与 ClfA 联合免疫抗体对黏附的抑制程度高于黏附素分子单独免疫组，FnBPA 分子 A 区对 ClfA 黏附抑制的增强作用优于 D 区，FnBPA-A 区与 Efb 相比对 ClfA 的黏附抑制增强差异不显著。

【结论】FnBPA-A、FnBPA-D 和 EfB 分别与 ClfA 联合免疫可不同程度地影响 ClfA 的黏附抑制效果，该结果为以黏附素分子为靶点的牛乳腺炎疫苗的研究提供了实验数据。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA) 不仅是引起人类多种传染性疾病的病原菌，还可感染奶牛引起顽固且危害严重的乳腺炎，严重制约奶牛业和乳品业的发展。尽管应用抗生素治疗该病是一种快速而方便的方法，但随着各种抗生素的广泛大量的应用，导致抗药性菌株的出现，进而影响治疗效果。此外，抗生素残留也会严重影响奶制品的品质。用 SA 疫苗预防由其引起的感染被认为是一种简便而节约的方法。

以往研究表明，SA 的黏附可介导该菌的入侵，是感染发生的先决条件。黏附素分子特异性抗体可抑制该菌的黏附功能，部分保护实验动物抵抗 SA 感染。SA 目前备受关注的黏附分子包括聚集因子 A (Clumping factor A，ClfA)、纤维连接蛋白结合蛋白 A (Fibronection binding protein A ， FnBPA) 和细胞外纤维蛋白原结合蛋白 (Extracellular fibrinogen-binding protein，EfB)。 ClfA 可介导 SA 黏附于基质蛋白，FnBPA 介导 SA 结合宿主细胞表面的纤维蛋白原和纤维连接素。 FnBPA 的 A 区(FnBPA-A)与 D 区(FnBPA-D)是该蛋白较受关注的功能区。EfB 除具有黏附功能外，还参与该菌的免疫逃避。目前认为利用黏附素特异抗体阻断 SA 乳腺上皮细胞的黏附是防治该菌引起乳腺炎的一种有效思路。以往有关黏附素分子联合免疫对牛乳腺原代上皮细胞黏附抑制的研究报道较少。

为从免疫的角度比较和分析 EfB 和 FnBPA 的不同功能区对 ClfA 黏附抑制的不同增强效果，本研究以 EfB、FnBPA-A 及 FnBPA-D 重组质粒分别单独及与 ClfA 联合免疫获得特异性多克隆抗体，通过对细胞进行菌落计数，比较不同免疫组合抗体对该菌黏附的抑制效果，同时采用荧光染色观察抗体的抑制效果，以期为合理利用黏附素分子实现对该菌引起的奶牛乳腺炎的防控提供参照。