大肠杆菌合成甘露醇实验讨论

      目前，微生物法生产甘露醇的菌株大多数为乳酸菌，Huhne 等[11]观察到一些乳酸菌最大的生长速率是葡萄糖和果糖的摩尔比在 1:2 时。由于果糖比葡萄糖贵得多，在微生物生产甘露醇过程中，用葡萄糖作为辅助因子的能源，加入的果糖被严格地转化成甘露醇，因此，果糖成为乳酸菌发酵生产甘露醇的必需品，但是果糖价钱较贵，而蔗糖相对便宜，并且大量存在于自然界中，因此，以蔗糖为底物生产甘露醇更有经济效益，大大降低了生物转化法生产甘露醇的成本，有望实现工业化生产。

      本研究中，通过将蔗糖水解酶基因和甘露醇脱氢酶基因以酶切位点连接的方式串联到表达载体 pET28a(+)上转化大肠杆菌，构建了一株蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶基因共表达菌株。

      根据 SDS-PAGE 得出的蛋白大小与预测分子量一致，证明已经实现了目的基因的表达，对酶活性进行了检测，蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶酶活达到 25.78 U/mL 和 14.56 U/mL，王芳[8] 也研究了将甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中克隆及表达，检测到甘露醇脱氢酶酶活仅为 9.32 U/mL，本实验酶活比其高出 56.22%，更有利于甘露醇的生产。研究发现，野生菌株存在产酶活性低、产酶种类复杂等原因，不利于生产应用。相比于野生菌株，大肠杆菌原核表达菌株的优势在于其生长迅速，能在短时间内就达到较高的酶活[12]。

      对重组菌株进行发酵条件的优化，确定发酵条件为：在菌体生长到 OD600 为 0.8 时，调节 pH 为 6.0，同时添加 0.1 mmol/L IPTG 和底物蔗糖，25 °C 诱导培养 10 h，利用 HPLC 法对甘露醇含量进行了测定，产量可达 45.19 g/L，转化率为 37.66%。其中底物蔗糖的添加方式为分批添加 3 次，维持发酵过程中较低的蔗糖浓度，因为基质浓度过高时造成的菌体生长抑制和酶活抑制，进而导致蔗糖利用率不高的现象，采用分批添加底物的方式，使原料得到最大程度的利用并获得最大产出的甘露醇。乳酸细菌发酵生产甘露醇的能力仍然偏低，要使产甘露醇的乳酸菌走向实际应用，必须对他们的甘露醇脱氢酶进行深入的研究，从分子水平上了解其催化反应机制，并对其结构进行改造以提高生产甘露醇的能力[13]。

寻找质优价廉的底物是微生物法生产甘露醇的关键，有效利用蔗糖中的聚合果糖和大肠杆菌的细胞工厂生物转化生产甘露醇，无疑是比较可行的路线之一。今后还应从整个己糖代谢途径考虑，应用代谢工程手段对乳酸细菌代谢途径进 行改造，可能会是实现甘露醇工业发酵的最终手段。